Eenzelfde kankerbehandeling slaat bij de ene patiënt aan en bij de andere niet. Die uitkomst is soms lastig te voorspellen voor artsen. Onderzoekers van het Nederlands Kanker Instituut onderzoeken of de samenstelling en ruimtelijke organisatie van cellen rond de tumor de uiteindelijke behandelrespons kan voorspellen. ‘Werden de immuuncellen buiten de tumor gehouden, of waren ze aan het infiltreren?’, zegt PhD-student Chloé Bazin. ‘Dat soort vragen kunnen we beantwoorden als we spatial gaan.’
Een tumor bestaat niet uitsluitend uit kankercellen, maar ook uit afweercellen, opruimcellen en bloedvaten. De positie van die cellen ten opzichte van elkaar lijkt mogelijk te bepalen of een behandeling zal aanslaan. Immuuntherapieën stimuleren het eigen afweersysteem om kankercellen aan te vallen. Deze werken bij sommige patiënten goed, maar slaan bij anderen onvoldoende aan. Tot nu toe is moeilijk met zekerheid te zeggen wie tot welke groep behoort. Daar ligt de aanleiding voor nieuw onderzoek: uit een biopt voorspellen wie baat heeft bij welke behandeling. Spatial biology brengt daarvoor in kaart welke cellen in de tumor zitten én waar ze zitten. Technisch komen daarin beeldvorming en kunstmatige intelligentie samen.
Wat één coupe wel en niet prijsgeeft
Elke coupe krijgt eerst de standaardkleuring met hematoxyline en eosine (de H&E-kleuring); celkernen paars, de rest roze. Die H&E-kleuring kost een dubbeltje en toont de weefselstructuur, maar onderscheidt lang niet alle celtypen. Klassieke pathologie snijdt voor elke volgende kleuring een nieuw plakje weefsel met de microtoom. Dat werkt zolang je iets over een heel gebied wilt weten, bijvoorbeeld over hormoonreceptorstatus met ER-, PR- of HER2-antilichaamkleuring. ‘Als we het hier zien in het ene plakje en we zien het daar ook in het andere, dan zal het wel bij elkaar zitten’, zegt image-analyst Rolf Harkes. Voor één afzonderlijke cel gaat die redenering niet op. Celkernen zijn ongeveer tien micrometer groot en de coupes vier. ‘Als je dan vier micrometer opschuift, is de kans groot dat je die ene cel niet meer hebt. Bij vijftien opeenvolgende kleuringen op steeds een nieuwe coupe weet je honderd procent zeker: diezelfde cel vind je niet meer terug.’
Ook de bestaande alternatieven schieten tekort. Flowcytometrie meet razendsnel wat voor cellen er zijn: “Je stuurt ze met duizend per seconde door een meetapparaat, maar daarvoor wordt het weefsel eerst afgebroken.” “De ruimtelijke verhouding tussen de cellen ben je dan kwijt”, legt Harkes uit. “Dat is juist wat telt: waar zaten de tumorcellen precies? Zaten ze in een klompje of juist verspreid? Werden de immuuncellen buiten de tumor gehouden of waren ze aan het infiltreren?”
Waarom de locatie ertoe doet
Neem vier biopten van vier patiënten met dezelfde diagnose. Conventionele analyse telt de cellen zonder te weten waar de cellen precies zitten, en vindt bij alle vier ongeveer dezelfde celtypen in ongeveer dezelfde verhoudingen. De ene patiënt reageert wel goed op een immuuntherapiemiddel en de andere niet. Spatial biology kan dat verschil zichtbaar maken. Bij een goede reactie zijn afweercellen en opruimcellen daadwerkelijk de tumor binnengedrongen en werken ze samen met andere immuuncellen om tumorcellen aan te vallen. Bij de patiënt die niet goed reageert, blijven de T-cellen die de tumor moeten aanvallen juist vaker hangen aan de rand van de tumor of in het omliggende weefsel. ‘Tumoren hebben veel verschillende manieren om aan het immuunsysteem te ontsnappen’, zegt Bazin. ‘De vraag is: hoe kun je vooraf al zien welk mechanisme daarvoor verantwoordelijk is?’
De verklaring voor een slechte respons is namelijk niet altijd hetzelfde. Soms remt de tumor T-cellen actief af: tumorcellen brengen moleculen op hun oppervlak tot expressie die de T-cel het signaal geven dat ze niet moeten aanvallen. Het afweersysteem staat klaar, maar komt niet in actie. In andere gevallen onttrekken tumorcellen zich aan herkenning, waardoor T-cellen ze niet als gevaarlijk herkennen. En weer in andere tumoren lukt het T-cellen niet om in het tumorweefsel door te dringen, omdat andere cellen een barrière om de tumor heen vormen. Spatial biology kan helpen om zulke ontsnappingsmechanismen te onderscheiden. Mogelijk hoeft een patiënt in de toekomst geen zware therapie te krijgen als al vaststaat dat die niet aanslaat. Daarbij zou het precieze mechanisme dat de tumorcellen gebruiken om het immuunsysteem te ontwijken de keuze van de behandeling kunnen bepalen. Maar zover is het nog niet: de meeste spatial biomarkers moeten nog in klinische studies gevalideerd worden.
Drie eiwitten per ronde
Om celtypen eenduidig vast te stellen, gebruiken de onderzoekers co-detection by indexing (CODEX), uitgevoerd met een PhenoCycler-Fusion. Daarmee worden herhaalde cycli gedaan om tientallen tot honderden eiwitmarkers in hetzelfde weefsel aan te kleuren, elk met een DNA-barcode. Het zichtbaar maken kan echter niet allemaal tegelijk. “De microscoop die we gebruiken kan maar vier kanalen tegelijk imagen”, zegt Harkes.
De oorzaak ligt in het lichtspectrum. De microscoop meet vier kanalen: blauw, groen, rood en infrarood. Het blauwe kanaal kleurt elke ronde de celkernen en levert daarmee het ankerpunt waarop de opnames later op elkaar passen. De overige drie kanalen registreren de eiwitmarkers. Meer kanalen toevoegen gaat mis, omdat kleuren die dicht bij elkaar liggen in het spectrum elkaar overlappen. Lekt er signaal van het ene eiwit naar het kanaal van het andere, dan wordt de identificatie van een cel onbetrouwbaar. High-end microscopen kunnen tot wel negen kanalen meten, maar er is veel controle en voorwerk nodig om dit betrouwbaar te doen, stelt Harkes: ‘De methode met vier kanalen is veel robuuster.’
De antilichamen gaan in één keer op de coupe. Daarna spoelen fluorescente reporters mee, elk met de DNA-barcode die past op de barcode van het betreffende antilichaam dat aan de beurt is om te imagen. De microscoop meet, een buffer zorgt ervoor dat de barcodes loskomen, de reporters spoelen weg en de volgende set komt erin met dezelfde kleur, maar een ander DNA-adres. Na tien tot vijftien cycli (afhankelijk van de grootte van het panel) zijn alle markers gemeten en alle meetpunten samengevoegd, waarna de image analysis start, zonder dat de coupe van de microscoop af hoeft. Zo komen niet alleen tumorcellen (met markers als PAN-CK en SOX10) en T-cellen (CD3, CD4, CD8) in beeld, maar ook hun toestand.
Dan volgt de derde dimensie. In een ander lab van het instituut maken onderzoekers hele stukken weefsel doorzichtig, de optical clearing, om er in 3D doorheen te kijken. ‘In de pathologie kijk je altijd naar één heel dun plakje tegelijk’, zegt promovendus Jeroen Doornbos terwijl hij door een transparant gemaakt stukje borstweefsel scrolt. ‘Nu kunnen we de complete verbindingen tussen gebieden laten zien.’ Daar staat een forse toename van de datastroom tegenover: een 2D-scanner verwerkt honderden coupes per etmaal, terwijl één 3D-opname al snel een week kost.
De analyse als knelpunt
Eén sample levert een dataset van ongeveer een terabyte op, met daarin miljoenen cellen. Om dit te kunnen analyseren, moet het beeld worden opgedeeld in verschillende objecten, de segmentatie. ‘Dat doen we bijvoorbeeld op de borstklier. Hierdoor kunnen we allerlei aspecten van de klier numeriek beschrijven, zoals de diktes van de kliergangen, het aantal klierblaasjes en de vormen van abnormale structuren’, legt Doornbos uit.
Tot een jaar of zes geleden bepaalden onderzoekers waar de ene cel ophield en de volgende begon met behulp van me de hand geprogrammeerde filters. Toen kwamen de deep-learning-netwerken die het konden automatiseren: StarDist, Cellpose en het Segment Anything-model van Meta. ‘Vroeger besteedden we hier een week aan, nu nog maar een uurtje’, zegt Harkes. Het gevolg was echter niet minder werk, maar meer vraag: grotere datasets en meer analyses.
Volautomatisch gaat het nog niet. Elk markerpanel is anders samengesteld: een panel voor prostaatkanker wijkt af van dat voor borstkanker of melanoom, dus het netwerk moet telkens leren welke markers de celkern aankleuren en welke het membraan. Met de hand aangeven welke markers wat aankleuren, werkt beter dan het model dat zelf laten uitzoeken. Een cel die helemaal is aangekleurd en rond oogt, houdt het netwerk anders al snel voor een celkern. ‘Als je dan uitlegt: nee, dit was echt de hele cel, dan wordt die segmentatie toch weer beter’, zegt Harkes.
Pas daarna komt de ruimtelijke vraag aan bod. Harkes schrijft scripts die de tumorcellen herkennen en het tumorgebied afbakenen. Vervolgens kijkt hij wat zich in een zone van vijftig micrometer daaromheen bevindt: welke immuuncellen liggen tegen de tumor aan, en welke blijven op afstand. Daarmee stuit het veld op zijn eigen grens. Een PhenoCycler-Fusion-coupe kost 1.500 euro. Wie spatial biology vaker wil inzetten, moet die keten dus radicaal goedkoper maken.
Wat het betekent voor de patiënt
De toepassing ligt in behandeling op maat. Melanoom was daarvan het eerste voorbeeld. Daar wordt sinds kort neoadjuvante immunotherapie toegepast, mede ontwikkeld in het NKI: de immuuntherapie gaat vooraf aan de operatie, terwijl de tumor nog in het lichaam zit. Er is dan meer doelwit om het afweersysteem op te activeren. Dat bleek in de PRADO-studie zo effectief dat operaties konden werden weggelaten of beperkt. In de NADINA-studie, met 423 patiënten met stadium 3-melanoom en gepubliceerd in 2024, reageerde zo’n 60 procent goed op de neoadjuvante behandeling met de combinatie van twee middelen. Maar bijna 37 procent behaalde geen goede pathologische respons, en bij ongeveer 30 procent veroorzaakte de behandeling ernstige bijwerkingen. De eerdere OpACIN-neo-studie liet zien dat de toxiciteit lager uitvalt bij een lagere dosis van een van de twee middelen.
Daar wringt het. Het spatial-biologyonderzoek wil daarom uit een biopt vóóraf voorspellen tot welke groep een patiënt behoort om vervolgens de behandeling te de-escaleren en het meest toxische middel weglaten bij patiënten die genoeg hebben aan minder, of juist te intensiveren bij wie meer nodig heeft. Onderzoeker Chloé Bazin: ‘De hypothese die we nu onderzoeken, is dat voorspellende aanwijzingen precies in dat ruimtelijke patroon zitten: de afstanden tussen tumorcellen en omliggende cellen hangen mogelijk samen met een betere respons.’
Het is daarmee een veld waarin de biologie de vragen stelt en de techniek de antwoorden moet leveren: in microscopen, in sequencers en vooral in de algoritmes die er een bruikbaar patroon uit halen. ‘Juist die ruimtelijke data’, zegt Bazin, ‘helpt ons een goed geïnformeerde hypothese te maken. En dat leidt hopelijk tot betere therapie.’
